还原型谷胱甘肽促进高糖成骨细胞的增殖和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (7): 985-990.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.001

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还原型谷胱甘肽促进高糖成骨细胞的增殖和分化

张琳琳¹，张静莹²，曲哲³，宋克东⁴，艾红军¹

¹中国医科大学口腔医学院口腔修复科，辽宁省沈阳市 110001；²大连大学医学院，辽宁省大连市 116622；³大连市口腔医院，辽宁省大连市 116000；⁴大连理工大学化学与生命科学院，辽宁省大连市 116024

出版日期:2015-02-12 发布日期:2015-02-12
通讯作者: 张静莹，博士,大连大学医学院，辽宁省大连市 116622
作者简介:张琳琳，女，1989年生，辽宁省大连人，汉族，中国医科大学在读硕士。
基金资助:
中国博士后科学基金面上项目(2014M551097)；辽宁省教育厅基金(2013481)；辽宁省博士启动基金(20141198)；大连市科技计划项目(2013E11SF057)

Reduced glutathione promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose conditions

Zhang Lin-lin¹, Zhang Jing-ying², Qu Zhe³, Song Ke-dong⁴, Ai Hong-jun¹

¹Department of Prosthodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; ²School of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China; ³Dalian Stomatological Hospital, Dalian 116000, Liaoning Province, China; ⁴School of Chemistry and Life Science, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning Province, China

Online:2015-02-12 Published:2015-02-12
Contact: Zhang Jing-ying, M.D., School of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, Liaoning Province, China
About author:Zhang Lin-lin, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by:
the China Postdoctoral Science Foundation of China, No. 2014M551097; the Fund of Liaoning Provincial Education Department, No. 2013481; the Doctor Startup Foundation of Liaoning Province, No. 20141198; the Scientific Plan Project of Dalian, No. 2013E11SF057

摘要/Abstract

摘要：

背景：糖尿病会通过影响成骨作用降低种植体的成功率并引起各种并发症。还原型谷胱甘肽可以通过酶反应直接或间接清除自由基，从而对成骨细胞的成骨起到一定保护作用。

目的：通过观察还原型谷胱甘肽对高糖环境下培养的成骨细胞的增殖和分化，以及对糖尿病兔骨缺损修复的影响，初步探讨还原型谷胱甘肽对高糖环境下成骨细胞的作用。

方法：将成骨细胞分为3组：正常对照组、高糖组、高糖+还原型谷胱甘肽组，通过对3种情况下MTT、碱性磷酸酶染色，观察还原型谷胱甘肽对高糖环境下成骨细胞增殖、分化的影响。在糖尿病新西兰兔骨缺损处放置还原型谷胱甘肽和骨粉的混合物，通过X射线观察还原型谷胱甘肽对糖尿病骨缺损修复的影响。

结果与结论：还原型谷胱甘肽能有效促进高糖环境下成骨细胞的增殖与分化，高糖+还原型谷胱甘肽组较高糖组细胞增殖明显(P < 0.05)；高糖+还原型谷胱甘肽组比高糖组细胞细胞分化程度显著提高(P < 0.05)。添加还原型谷胱甘肽的糖尿病模型兔胫骨骨缺损处的骨密度影较单纯骨粉修复兔更明显(P < 0.05)。结果证实，还原型谷胱甘肽能促进高糖环境下成骨细胞的增殖及分化，促进糖尿病兔胫骨骨缺损处新生骨修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 还原型谷胱甘肽, 成骨细胞, 糖尿病, 骨质疏松, 增殖, 分化, 胫骨, 骨密度

Abstract:

BACKGROUND: Diabetes can reduce the success rate of implants by affecting osteogenesis. What’s more, it also causes a variety of complications. Reduced glutathione can remove free radicals directly or indirectly by an enzymatic reaction, and thus plays a protective role on osteoblasts.

OBJECTIVE: To evaluate the effects of reduced glutathione on the proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose conditions and the influence on bone defects of diabetes rabbits.

METHODS: In this experiment, the osteoblasts were divided into three groups: normal control group, high glucose group, high glucose+reduced glutathione group. We observed the proliferation and differentiation of osteoblasts by alkaline phosphatase staining and MTT. The diabetes rabbits which had bone defects were divided into two groups, and the mixture of reduced glutathione and Bioss was used to fill the bone defects in the experimental group to judge the influence of reduced glutathione on osteogenesis based on X-ray observation.

RESULTS AND CONCLUSION: Reduced glutathione could effectively promote the proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose conditions. The cell proliferation and differentiation showed more significant increase in the high glucose+reduced glutathione group than the high glucose group (P < 0.05). The bone mineral density shadow of the tibial bone defects after treatment with the mixture of reduced glutathione and Bioss was significantly higher than that after treatment with single Bioss (P < 0.05). These findings indicate that reduced glutathione can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts, and effectively promote the repair of bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Tissue Engineering, Osteoblasts, Diabetes Mellitus, Osteoporosis

中图分类号:

R318

张琳琳，张静莹，曲哲，宋克东，艾红军. 还原型谷胱甘肽促进高糖成骨细胞的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(7): 985-990.

Zhang Lin-lin, Zhang Jing-ying, Qu Zhe, Song Ke-dong, Ai Hong-jun. Reduced glutathione promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(7): 985-990.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析纳入兔20只，进入结果分析18只，2只兔注射四氧嘧啶后出现抽搐死亡，最终计入结果分析为18只。

2.2 成骨细胞的形态成骨细胞传代培养3代后，细胞充分铺展，形态多样，呈三角形、梭形、多角形等不规则形。光学显微镜下可见细胞有长短不一的突起，可见胞核，胞质丰富，呈集落样生长趋势，集落中心细胞排列紧密。随着培养时间的延长，细胞伸出很多突起，突起延长，细胞之间通过突起相互接触，融合成片。传代培养约7 d，细胞几乎布满平底，形成单层细胞，细胞成簇融合。见图1。

2.3 成骨细胞的鉴定结果苏木精-伊红染色可见，培养的细胞多呈三角形或梭形，为成骨细胞典型形态，胞浆丰富，被伊红染成粉红色。细胞内可见蓝色颗粒，为嗜苏木精的蓝色颗粒，为细胞核。呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，核仁明显。细胞核在非有丝分裂期为圆形或者椭圆形，随着时间的延长，细胞核逐渐被拉长。到细胞有丝分裂期，细胞核分裂成两个，逐渐形成两个一样的孪生细胞，见图2A。

Von-Kossa法是染色矿化结节的经典方法，其原理是利用硝酸银与钙盐的复分解反应形成可被还原的银盐，在强光或紫外光下生成金属银。染色结果可以看到大量钙化结节形成，细胞聚集，结节呈黑色，说明细胞产生出了钙盐，进而表明分离出的细胞具有矿化能力，为成骨细胞，见图2B。

茜素红染色法是目成骨细胞前矿化结节染色主要方法，其原理是由于矿化结节中含有大量的钙盐，可与茜素红发生显色反应，产生一种深红色的化合物。可以看到细胞呈多层重叠生长，细胞局部堆集成灶状，形成钙结节，钙结节染成橘红色，进一步说明细胞有矿化能力为成骨细胞，见图2C。

2.4 成骨细胞的增殖情况成骨细胞在3中不同条件下培养1，2，3天，随着培养时间的增加，各组细胞呈增殖趋势。

从图3中可见高糖组(HG)培养的细胞在1，2，3天时细胞数量与正常血糖组(NG)和高糖+还原型谷胱甘肽组(HG+GSH)比较，差异均有显著性意义(P < 0.01)，可见高糖培养环境会抑制细胞增殖的速度，使细胞增殖的数量减少；高糖+还原型谷胱甘肽组的细胞也呈现出增殖的趋势，但数量在培养1，2，3天时都显著高于高糖组，而且差异有显著性意义(P < 0.01)，说明还原型谷胱甘肽对高糖培养环境下细胞的增殖有一定的促进作用，可以在一定程度上保护细胞不受高糖培养环境的影响。高糖+还原型谷胱甘肽组在培养1，2，3天与正常对照组的细胞数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明还原型谷胱甘肽通过对高糖培养成骨细胞的保护作用，几乎可以抵消高糖培养对细胞增殖的抑制作用，呈现出促进细胞增殖的作用。

2.5 成骨细胞的分化情况在光学显微镜下观察发现，在细胞膜上及其周围有多个蓝色细微颗粒，在胞浆内也可见到少量颗粒，此为碱性磷酸酶阳性细胞。

高糖+还原型谷胱甘肽组可见大量染色细胞出现，细胞胞浆被染成蓝黑色。相比于高糖组染色更加明显，被染色的细胞量显著增多。而正常对照组与高糖+还原型谷胱甘肽组没有显著差异。结果表明，高糖培养环境对成骨细胞的增殖和分化具有显著的抑制作用，而还原型谷胱甘肽可以促进成骨细胞的分化，见图4。

2.6 四氧嘧啶糖尿病兔动物模型的鉴定结果新西兰大白兔注射四氧嘧啶24 h后，出现多饮、多尿、多食的表现。分别于建模1，4周后，检测兔耳缘静脉血糖，血糖值均大于16.7 mmol/L，并且显著高于建模前。据此，实验认定建模成功(2只兔注射四氧嘧啶后出现抽搐死亡)，建模后兔子体质量发生显著下降，出现明显的消瘦，与建模前比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.7 糖尿病模型兔胫骨的愈合在骨缺损处放入骨粉 10 d后，通过对糖尿病兔缺损胫骨的X射线片观察发现，放入还原型谷胱甘肽和骨粉混合物的实验组骨缺损处的骨密度影有明显加强，而没有放入还原型谷胱甘肽只放入骨粉的对照组的骨密度影只有轻微加强，见图5。结果表明，还原型谷胱甘肽可以促进骨缺损处矿物质的沉积，从而有效促进骨质缺损的修复重建。

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引言

牙种植体在义齿修复中的成功应用是近年来口腔医学领域取得的突破性进展，但随着种植体临床使用观察期的延长，发现愈来愈多的种植后并发症影响其远期成功率。糖尿病是严重威胁人类健康的常见内分泌代谢疾病，发病率正逐年上升。WHO报告2002年全世界约有1.5亿糖尿病患者，预测到2025年将上升到3亿，糖尿病是人类致死、致残的主要原因之一，糖尿病引起的慢性高血糖影响机体不同的组织结构，刺激骨吸收、影响骨形成，引起骨质疏松^[1]。

研究表明糖尿病引发骨质疏松的发病机制可能与以下因素有关：高血糖引起体内多种物质自由氨基与葡萄糖醛基或酮基发生糖基化反应，形成糖基化终末产物，糖基化终末产物与细胞表面受体结合，生成大量自由基，通过氧化应激反应破坏体内正常细胞^[2]；高血糖上调破骨细胞分化基因的表达，抑制成骨细胞分化^[3-4]；长期高血糖导致肾脏对钙和磷排出增加，胰岛素分泌减少，从而导致骨质脱钙，骨密度下降^[5]。Bownlee^[6]提出氧化应激是高糖介导组织损伤的主要原因，慢性高血糖导致线粒体能量代谢障碍，生成大量的氧自由基，影响细胞内的信号传导途径，影响骨基质沉积，使之改建和矿化不足^[7]。氧化应激在糖尿病及其慢性并发症的发生、发展过程中起了重要作用，抗氧化治疗可以减轻氧化应激，从而阻止或延缓糖尿病及其慢性并发症的发生、发展^[8]。还原型谷胱甘肽是谷胱甘肽抗氧化的主要形式，存在于所有动物细胞中，在许多生命活动中起着直接或间接的作用，包括清除氧自由基、增强抗氧化物酶活性、提高机体抗氧化防御能力等作用，其能提供含巯基的半胱氨酸，结合自由基，清除过氧化氢或其他过氧化物等有害物质^[9]。目前已广泛应用于肝损害、肾损害、眼部疾病、心脑血管病和帕金森病等多系统多脏器疾病中，已成为多种疾病治疗和辅助治疗的药物^[10-16]。

实验通过还原型谷胱甘肽对高糖成骨细胞的增殖、分化影响，初步探讨还原型谷胱甘肽对糖尿病骨质疏松的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学实验。

时间及地点：于2014年2至10月在大连理工大学干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：健康5月龄清洁级雄性新西兰兔20只，许可证号：SCXK(辽)2002-0002；体质量2.5-4.0 kg，3 d内新生SD大鼠，均购自大连医科大学实验动物中心，实验动物饲养及实验符合大连医科大学实验动物管理规定，实验经大连大学大学附属中山医院伦理委员会讨论批准。

方法：

成骨细胞的培养和鉴定：取新生3 d内SD大鼠，颈部处死后放入体积分数75%乙醇中消毒5 min，取出颅骨，用PBS洗净血液，刮除骨膜和结缔组织，将颅骨剪碎约 0.5 mm× 0.5 mm大小的骨片，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃恒温消化20 min，吸出消化液，之后体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶 37 ℃恒温消化20 min后离心，弃上清液，加入含体积分数15%血清的DMEM培养基，吹打骨片，将细胞悬液接种于培养瓶中，置37 ℃ CO₂恒温孵育箱中培养^[17]。

苏木精-伊红染色：将长有细胞的盖玻片用PBS洗3次，浸入体积分数95%的乙醇中固定15 min，PBS洗2次，每次1 min；浸入苏木精染液，染色5 min；自来水浸洗，浸入稀盐酸乙醇进行分色，自来水浸洗；浸入淡氨水中，使胞核蓝化，3 min，自来水浸洗；浸入伊红染液，染色 5 min，自来水浸洗；依次经过体积分数75%，85%，95%乙醇各1次，100%乙醇2次逐级脱水，每次3 min；1∶1无水乙醇和二甲苯，3 min，通过二甲苯2次，每次3 min。最后滴上中性树胶封固，将有细胞的一面向下固定于载玻片上。

茜素红染色^[18]：将细胞以1×10⁴个/孔接种于24孔板，每隔3 d换液，于14 d进行染色。吸去培养基，PBS清洗2遍，体积分数95%乙醇固定2 min，去离子水冲洗3次，体积分数0.1%茜素红-Tris-HCl (pH 8.3)染色30 min，去离子水冲洗，空气干燥，中性树胶封固。用光学显微镜观察。

Von-kossa染色^[19]：弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，40 g/L多聚甲醛固定标本，体积分数5%硫代硫酸钠孵育 30 min，蒸馏水冲洗，然后用1%硝酸银溶液避光染色 30 min，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质，继续用体积分数5%硫代硫酸钠染色2 min，体积分数1%中性红复染10 min，蒸馏水漂洗后观察。

还原型谷胱甘肽对高糖成骨细胞的增殖：实验分为3组：正常对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的DMEM+体积分数1%胎牛血清，NG)，高糖组(葡萄糖浓度为25 mmol/L 的DMEM+体积分数1%胎牛血清)，高糖+还原型谷胱甘肽组(葡萄糖浓度为25 mmol/L的DMEM+体积分数1%胎牛血清+还原型谷胱甘肽5 mol/L)，还原型谷胱甘肽由上海生工生物技术公司提供。将成骨细胞制成细胞浓度为2×10⁷ L^-1的细胞悬液，接种于3块24孔板中，每组复种3孔，各孔加入500 μL的细胞悬液，分别置于37 ℃体积分数5% CO₂的细胞培养箱内培养1，3，5 d，PBS清洗后加入 MTT 550 μL (质量浓度为5 g/L的50 μL MTT与500 μL无血清DMEM混合)，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中继续培养4 h。吸出MTT加入400 μL DMSO，震荡溶解10 min，将24孔板中每孔的液体100 μL转入相应96孔板中(24孔板1孔液体平均转入96孔板的4孔)，用酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度值(A值)^[20]。MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能催化MTT形成紫色结晶物，该结晶数的多少与活细胞数量和功能成正比，并且结晶可在DMSO中溶解，分光光度计测定A值，以反映出相对活细胞数目。测定成骨细胞连续生长7 d的A值与细胞数，观察细胞生长曲线变化。实验在相同条件下重复3次。

还原型谷胱甘肽对高糖成骨细胞的分化：碱性磷酸酶是成骨细胞分化成熟标记酶，可能参与骨基质成熟钙化过程的调节，促进Ca²⁺在基质中的沉积，因此，碱性磷酸酶染色强阳性是成骨细胞的重要特征之一。实验通过采用钙钴细胞化学染色法观察碱性磷酸酶的表达来鉴定成骨细胞的成熟分化。用钙钴法进行碱性磷酸酶染色，细胞分组同上，成骨细胞传代培养第7天，弃去孔内原培养基，PBS漂洗，POM固定15 min，蒸馏水漂洗数遍后，加入NBT/BCIP染液(碱性磷酸酶显色缓冲液3 mL，BCIP溶液10 µL，NBT溶液20 µL)，每孔充分覆盖样品，37 ℃避光孵育30 min，蒸馏水洗涤3次，终止显色反应后显微镜下观察摄片。

还原型谷胱甘肽对糖尿病兔骨缺损修复的影响：取5月龄健康雄性新西兰大白兔20只，随机分为2组：对照组(糖尿病模型)、实验组(糖尿病+还原型谷胱甘肽干预)。兔适应性饲养7 d，室温(22±2) ℃，相对湿度(55±10)%，光暗周期12 h：12 h，换气20次/h，再次称质量计算平均体质量；禁食12 h后取耳缘静脉血检测血糖，隔日重复测量，确定血糖基础值。应用3次(每周1次)耳缘静脉注射四氧嘧啶(streptozotocin，STZ，80 mg/kg)法制备糖尿病兔模型^[21-23]，观察并记录新西兰大兔在注射药物后的反应(精神状态、饮食、血糖)，检测给药前后空腹血糖变化情况，定期称质量。待血糖稳定后每周检测血糖一两次，检测耳缘静脉空腹血糖持续≥16.7 mmol/L，尿糖+++至++++确定为糖尿病模型制备成功。速眠新(0.15 mL/kg)全身麻醉，体积分数4%盐酸阿替卡因和1/100 000肾上腺素局部麻醉，无菌条件下，在胫骨骺段制备4 mm直径圆孔，分别放入还原型谷胱甘肽与骨粉(从小牛骨的矿物质成分中获取的一种天然骨替代材料)的混合物，在预备过程中注意大量生理盐水(含青霉素)冲洗，防止局部温度过高。充分冲洗后，逐层缝合。术后每日肌注硫酸庆大霉素，4×10⁵ U/d，并观察伤口愈合情况。术后2周处死兔，取胫骨去除软组织后置于体积分数4%甲醛溶液中，在4 ℃条件下固定7 d。JY-YIS-8--B X光机观察骨质生长情况。

主要观察指标： ①各组成骨细胞的形态、数量随时间的变化，成骨细胞分泌碱性磷酸酶量的比较。②兔骨缺损处的愈合情况。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 11.5软件拟合得出A值(X)与细胞数量(Y)之间的关系，Y=2E+06X-240 636，用origin Pro 7.5软件绘制各组细胞数与培养时间的柱状图。采用单因素方差分析进行多组间数据差异的比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

正常情况下机体可以进行一系列的自由基清除，而高糖环境使机体的自由基清除减少，氧自由基可以破坏成骨细胞的活性，从而影响成骨细胞增殖分化，导致骨质疏松^[24-25]。机体清除各种活性氧和自由基的酶系统，主要有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷光甘肽转硫酶、铜蓝蛋白；提供还原当量的各种脂溶性、水溶性化合物^[26]。还原型谷胱甘肽是非酶性抗氧化剂，是细胞合成的抗氧化剂，通过其巯基氧化-还原态的转换，提供抗氧化保护^[27]，-SH是还原型谷胱甘肽最重要的功能基团，参与机体内多种重要生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活而保证能量代谢、细胞利用^[28]。还原型谷胱甘肽还可作为供氢体促进谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧酶等酶类催化的过氧化物还原反应，参与直接清除自由基，在维持细胞内氧化还原平衡中扮演极其重要的角色^[29]。在去卵巢骨质疏松大鼠模型中，还原型谷胱甘肽在还原型谷胱甘肽过氧化物酶的作用下对过氧化氢进行还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，从而对骨质疏松模型起到代偿性保护^[30]。

通过对成骨细胞在高糖环境下的体外培养，实验发现还原型谷胱甘肽对成骨细胞的具有保护作用。这种保护作用通过MTT实验结果表现在能有效促进成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶染色结果也验证了还原型谷胱甘肽可以促进其成熟矿化并保护成骨细胞。而动物实验的结果证实了还原型谷胱甘肽可以促进骨缺损处的矿物质沉积。通过以上分析，实验可以初步得出结论，还原型谷胱甘肽促进成骨作用很可能是通过参与体内的氧化还原反应清除自由基，从而对成骨细胞起到保护作用，其作用机制有待于进一步的深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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还原型谷胱甘肽促进高糖成骨细胞的增殖和分化

Reduced glutathione promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose conditions

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